Фактори на мешање во реакциите на PCR

За време на реакцијата на ПЦР, често се среќаваат некои фактори што се мешаат.
Поради многу високата чувствителност на ПЦР, загадувањето се смета за еден од најважните фактори кои влијаат на резултатите од ПЦР и можат да дадат лажни позитивни резултати.
Подеднакво критични се различните извори што водат до лажно-негативни резултати. Ако еден или повеќе суштински делови од мешавината PCR или самата реакција на засилување се инхибираат или се мешаат, може да се спречи дијагностичката анализа. Ова може да доведе до намалена ефикасност, па дури и лажни негативни резултати.
Покрај инхибицијата, губење на интегритетот на целната нуклеинска киселина може да се појави како резултат на испорака и/или услови за складирање пред подготовката на примерокот. Особено, високите температури или несоодветното складирање може да доведат до оштетување на клетките и нуклеинските киселини. Фиксацијата на клетките и ткивата и вградувањето на парафин се добро познати причини за фрагментација на ДНК и постојан проблем (види слики 1 и 2). Во овие случаи, дури и оптималната изолација и прочистување нема да помогне.

Слика 1 | Ефект на имобилизација врз интегритетот на ДНК
Електрофорезата на агароза гел покажа дека квалитетот на ДНК изолиран од парафинските делови на обдукциите значително се разликува. ДНК со различна просечна должина на фрагмент беше присутна во екстрактите во зависност од методот на фиксација. ДНК беше зачувана само кога се фиксираат во мајчин замрзнати примероци и во тампонирана неутрална формалин. Употребата на силно кисела буин фиксативна или небукувана, формалин што содржи формична киселина резултираше со значително губење на ДНК. Останатиот дел е многу фрагментиран.
Лево, должината на фрагментите се изразува во парови на килобаза (KBP)

Слика 2 | Губење на интегритетот на целите на нуклеинската киселина
(А) Јазот од 3′-5 and на двете нишки ќе резултира во пауза во целната ДНК. Синтезата на ДНК сепак ќе се појави на малиот фрагмент. Меѓутоа, ако место за прицврстување на прајмер недостасува на фрагментот на ДНК, се јавува само линеарно засилување. Во најповолен случај, фрагментите може да се рестурираат едни со други, но приносите ќе бидат мали и под нивото на откривање.
(б) Губење на бази, главно како резултат на формирање на декурацијата и тимидин, доведува до намалување на бројот на H-обврзници и намалување на ТМ. За време на издолжената фаза на затоплување, букварите ќе се стопат од ДНК на матрицата и нема да се анерираат дури и под помалку строги услови.
(в) Соседните тимински бази формираат TT димер.
Друг вообичаен проблем што често се јавува кај молекуларната дијагностика е помалку-оптималното ослободување на целните нуклеински киселини во споредба со екстракцијата на фенол-хлороформ. Во екстремни случаи, ова може да биде поврзано со лажни негативи. Многу време може да се заштеди со вриење на лиза или ензимско варење на остатоци од клетки, но овој метод често резултира во ниска чувствителност на PCR заради недоволно ослободување на нуклеинска киселина.

Инхибиција на активност на полимераза за време на засилување

Општо, инхибицијата се користи како концепт на контејнери за да се опишат сите фактори што доведуваат до субтопимални резултати на PCR. Во строго биохемиска смисла, инхибицијата е ограничена на активност на ензимот, т.е., ја намалува или спречува конверзијата на подлогата-производ преку интеракција со активното место на ДНК полимеразата или неговиот кофактор (на пр. Mg2+ за TAQ DNA полимераза).
Компонентите во примерокот или разни тампони и екстракти кои содржат реагенси можат директно да го инхибираат ензимот или да ги стапат во кофакторите (на пр. ЕДТА), а со тоа да се деактивира полимеразата и за возврат да доведе до намалени или лажни негативни резултати на ПЦР.
Сепак, многу интеракции помеѓу компонентите на реакција и нуклеинските киселини кои содржат целни, исто така, се означени како „PCR инхибитори“. Откако интегритетот на клетката е нарушен со изолација и се ослободува нуклеинската киселина, може да се појават интеракции помеѓу примерокот и околниот раствор и цврстата фаза. На пример, „чистачите“ можат да врзуваат единечна или двојно влакно ДНК преку не-ковалентни интеракции и да се мешаат во изолацијата и прочистувањето со намалување на бројот на цели што на крајот стигнуваат до садот за реакција на ПЦР.
Општо, PCR инхибиторите се присутни во повеќето телесни течности и реагенси што

Повеќе распространети PCR инхибитори можат да се најдат во бактерии и еукариотски клетки, не-целни ДНК, макромолекули кои се врзуваат за ДНК на ткиво матрици и лабораториска опрема како што се нараквици и пластика. Прочистување на нуклеински киселини за време или по екстракција е најпосакуваниот метод за отстранување на инхибиторите на PCR.
Денес, различна опрема за автоматска екстракција може да замени многу рачни протоколи, но 100% закрепнување и/или прочистување на целите никогаш не е постигнато. Потенцијалните инхибитори сè уште можат да бидат присутни кај прочистените нуклеински киселини или може да стапат на сила. Постојат различни стратегии за да се намали влијанието на инхибиторите. Изборот на соодветна полимераза може да има значително влијание врз активноста на инхибиторот. Други докажани методи за намалување на инхибицијата на ПЦР се зголемуваат концентрација на полимераза или примена на адитиви како што е БСА.
Инхибиција на реакции на PCR може да се демонстрира со употреба на контрола на квалитетот на внатрешниот процес (IPC).
Мора да се внимава да се отстранат сите реагенси и другите раствори во комплетот за екстракција, како што се етанол, ЕДТА, ЦЕТАБ, ЛИЦЛ, ГУСЦН, СДС, Изопропанол и Фенол, од нуклеинска киселина изолираат со темелен чекор на миење. Во зависност од нивната концентрација, тие можат да го активираат или инхибираат PCR.