Интерферентни фактори во PCR реакциите

За време на PCR реакцијата, често се среќаваат некои интерферентни фактори.
Поради високата чувствителност на PCR, контаминацијата се смета за еден од најважните фактори кои влијаат на резултатите од PCR и може да произведе лажно позитивни резултати.
Подеднакво критични се различните извори кои водат до лажно-негативни резултати. Ако еден или повеќе суштински делови од мешавината на PCR или самата реакција на засилување се инхибирани или попречени, дијагностичката анализа може да биде попречена. Ова може да доведе до намалена ефикасност, па дури и до лажни негативни резултати.
Покрај инхибицијата, може да дојде до губење на интегритетот на целната нуклеинска киселина поради условите за испорака и/или складирање пред подготовката на примерокот. Особено, високите температури или несоодветното складирање може да доведат до оштетување на клетките и нуклеинските киселини. Фиксацијата на клетките и ткивата и вградувањето на парафин се добро познати причини за фрагментација на ДНК и постојан проблем (види слики 1 и 2). Во овие случаи, дури и оптималната изолација и прочистување нема да помогнат.

Слика 1 | Ефект на имобилизацијата врз интегритетот на ДНК
Електрофорезата со гел агароза покажа дека квалитетот на ДНК изолирана од парафинските делови од аутопсиите значително варира. ДНК со различна просечна должина на фрагментите беше присутна во екстрактите во зависност од методот на фиксација. ДНК беше зачувана само кога беше фиксирана во природни замрзнати примероци и во пуфериран неутрален формалин. Употребата на силно кисел Bouin фиксатор или формалин што содржи мравја киселина без пуфер, резултираше со значително губење на ДНК. Преостанатата фракција е многу фрагментирана.
Лево, должината на фрагментите е изразена во килобазни парови (kbp)

Слика 2 | Губење на интегритетот на целите на нуклеинската киселина
(а) Јазот од 3'-5' на двете жици ќе резултира со прекин на целната ДНК. синтезата на ДНК сепак ќе се случи на малиот фрагмент. Меѓутоа, ако на фрагментот на ДНК недостасува место за жарење на прајмер, се случува само линеарно засилување. Во најповолниот случај, фрагментите може повторно да се заситуваат еден со друг, но приносите ќе бидат мали и под нивото на детекција.
(б) Губењето на базите, главно поради депуринација и формирање на тимидин димер, доведува до намалување на бројот на H-врски и намалување на Tm. За време на издолжената фаза на затоплување, прајмерите ќе се стопат од матриксната ДНК и нема да се анектираат дури и под помалку строги услови.
(в) Соседните бази на тимин формираат ТТ димер.
Друг заеднички проблем што често се јавува во молекуларната дијагностика е помалку од оптимално ослободување на целните нуклеински киселини во споредба со екстракцијата на фенол-хлороформ. Во екстремни случаи, ова може да биде поврзано со лажни негативни. Многу време може да се заштеди со врела лиза или ензимско варење на клеточниот отпад, но овој метод често резултира со ниска чувствителност на PCR поради недоволно ослободување на нуклеинска киселина.

Инхибиција на активноста на полимеразата за време на засилување

Општо земено, инхибицијата се користи како концепт на контејнер за да се опишат сите фактори кои водат до неоптимални резултати на PCR. Во строго биохемиска смисла, инхибицијата е ограничена на активноста на ензимот, т.е. ја намалува или спречува конверзијата на супстрат-производ преку интеракција со активното место на ДНК полимеразата или нејзиниот кофактор (на пример, Mg2+ за Taq ДНК полимеразата).
Компонентите во примерокот или различни пуфери и екстракти кои содржат реагенси може директно да го инхибираат ензимот или да ги заробат неговите кофактори (на пр. ЕДТА), а со тоа да ја инактивираат полимеразата и за возврат да доведат до намалени или лажно негативни резултати на PCR.
Сепак, многу интеракции помеѓу компонентите на реакцијата и нуклеинските киселини што содржат цел се исто така означени како 'инхибитори на PCR'. Откако интегритетот на клетката ќе се наруши со изолација и ќе се ослободи нуклеинската киселина, може да се појават интеракции помеѓу примерокот и неговиот околен раствор и цврстата фаза. На пример, „чистачите“ можат да врзат едно- или двоверижна ДНК преку нековалентни интеракции и да се мешаат во изолацијата и прочистувањето со намалување на бројот на цели кои на крајот ќе стигнат до садот за реакција на PCR.
Општо земено, инхибиторите на PCR се присутни во повеќето телесни течности и реагенси кои се користат за клинички дијагностички тестови (уреа во урината, хемоглобин и хепарин во крвта), додатоци во исхраната (органски компоненти, гликоген, масти, јони на Ca2+) и компоненти во околината (феноли, тешки метали)

Пораспространетите ПЦР инхибитори може да се најдат во бактериите и еукариотските клетки, нецелната ДНК, макромолекули на ткиво матрици што врзуваат ДНК и лабораториската опрема како што се ракавици и пластика. Прочистувањето на нуклеинските киселини за време или по екстракција е префериран метод за отстранување на инхибиторите на PCR.
Денес, разновидна опрема за автоматско извлекување може да замени многу рачни протоколи, но никогаш не е постигнато 100% обновување и/или прочистување на целите. Потенцијалните инхибитори може сè уште да бидат присутни во прочистените нуклеински киселини или можеби веќе стапиле во сила. Постојат различни стратегии за намалување на влијанието на инхибиторите. Изборот на соодветна полимераза може да има значително влијание врз активноста на инхибиторот. Други докажани методи за намалување на инхибицијата на PCR се зголемување на концентрацијата на полимеразата или примена на адитиви како што е BSA.
Инхибицијата на PCR реакциите може да се докаже со употреба на внатрешна контрола на квалитетот на процесот (IPC).
Мора да се внимава да се отстранат сите реагенси и други раствори во комплетот за екстракција, како што се етанол, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, изопропанол и фенол, од изолатот на нуклеинска киселина со темелно миење. Во зависност од нивната концентрација, тие може да го активираат или инхибираат PCR.