Интерферентни фактори во PCR реакциите

За време на PCR реакцијата, често се среќаваат некои интерферентни фактори.
Поради многу високата чувствителност на PCR, контаминацијата се смета за еден од најважните фактори што влијаат на резултатите од PCR и може да даде лажно позитивни резултати.
Подеднакво критични се различните извори што водат до лажно негативни резултати. Доколку еден или повеќе суштински делови од PCR смесата или самата реакција на амплификација се инхибирани или попречени, дијагностичкиот тест може да биде попречен. Ова може да доведе до намалена ефикасност, па дури и до лажно негативни резултати.
Покрај инхибицијата, губењето на интегритетот на целната нуклеинска киселина може да се случи поради условите за транспорт и/или складирање пред подготовката на примерокот. Особено, високите температури или несоодветното складирање може да доведат до оштетување на клетките и нуклеинските киселини. Фиксацијата на клетките и ткивата и вградувањето во парафин се добро познати причини за фрагментација на ДНК и постојан проблем (видете ги сликите 1 и 2). Во овие случаи, дури и оптималната изолација и прочистување нема да помогнат.

Слика 1 | Ефект на имобилизацијата врз интегритетот на ДНК
Електрофорезата со агарозен гел покажа дека квалитетот на ДНК изолирана од парафински делови од обдукции значително варира. ДНК со различни просечни должини на фрагментите беше присутна во екстрактите во зависност од методот на фиксација. ДНК беше зачувана само кога беше фиксирана во природни замрзнати примероци и во пуфериран неутрален формалин. Употребата на силно кисел фиксатор Буен или непуфериран формалин што содржи мравја киселина резултираше со значителна загуба на ДНК. Преостанатата фракција е високо фрагментирана.
Лево, должината на фрагментите е изразена во килобазни парови (kbp)

Слика 2 | Губење на интегритетот на целите на нуклеинската киселина
(a) Јаз од 3′-5′ на обете нишки ќе резултира со прекин во целната ДНК. Синтезата на ДНК сè уште ќе се случи на малиот фрагмент. Меѓутоа, ако местото на жарење на прајмерот недостасува на ДНК фрагментот, се случува само линеарна амплификација. Во најповолниот случај, фрагментите може да се ресатурираат едни со други, но приносите ќе бидат мали и под нивоата на детекција.
(б) Губењето на бази, главно поради депуринација и формирање на тимидински димери, доведува до намалување на бројот на H-врски и намалување на Tm. За време на продолжената фаза на затоплување, прајмерите ќе се стопат од матриксната ДНК и нема да се жарат дури ни под помалку строги услови.
(в) Соседните тимински бази формираат TT димер.
Друг чест проблем што често се јавува во молекуларната дијагностика е помалку од оптималното ослободување на целните нуклеински киселини во споредба со екстракцијата со фенол-хлороформ. Во екстремни случаи, ова може да биде поврзано со лажно негативни резултати. Може да се заштеди многу време со варење на лиза или ензимска дигестија на клеточните остатоци, но овој метод често резултира со ниска PCR чувствителност поради недоволно ослободување на нуклеински киселини.

Инхибиција на полимеразната активност за време на амплификација

Општо земено, инхибицијата се користи како концепт на контејнер за да се опишат сите фактори што водат до неоптимални резултати од PCR. Во строго биохемиска смисла, инхибицијата е ограничена на активноста на ензимот, т.е. ја намалува или спречува конверзијата на супстрат-производ преку интеракција со активното место на ДНК полимеразата или нејзиниот кофактор (на пр., Mg2+ за Taq ДНК полимераза).
Компонентите во примерокот или разните пуфери и екстракти што содржат реагенси можат директно да го инхибираат ензимот или да ги заробат неговите кофактори (на пр. EDTA), со што се инактивира полимеразата и за возврат доведува до намалени или лажно негативни PCR резултати.
Сепак, многу интеракции помеѓу компонентите на реакцијата и нуклеинските киселини што содржат цел се означени и како „PCR инхибитори“. Откако интегритетот на клетката ќе се наруши со изолација и нуклеинската киселина ќе се ослободи, може да се појават интеракции помеѓу примерокот и неговиот околн раствор и цврста фаза. На пример, „чистачите“ можат да се врзат за едноверижна или двоверижна ДНК преку нековалентни интеракции и да се мешаат во изолацијата и прочистувањето со намалување на бројот на цели што на крајот стигнуваат до садот за PCR реакција.
Генерално, PCR инхибиторите се присутни во повеќето телесни течности и реагенси што се користат за клинички дијагностички тестови (уреа во урина, хемоглобин и хепарин во крв), додатоци во исхраната (органски компоненти, гликоген, масти, Ca2+ јони) и компоненти во животната средина (феноли, тешки метали).

Пораспространети PCR инхибитори може да се најдат кај бактерии и еукариотски клетки, нецелна ДНК, макромолекули што се врзуваат за ДНК од ткивни матрици и лабораториска опрема како што се ракавици и пластика. Прочистувањето на нуклеинските киселини за време или по екстракцијата е претпочитаниот метод за отстранување на PCR инхибиторите.
Денес, разновидна опрема за автоматизирана екстракција може да замени многу рачни протоколи, но 100% обновување и/или прочистување на целите никогаш не е постигнато. Потенцијалните инхибитори може сè уште да бидат присутни во прочистените нуклеински киселини или можеби веќе имаат ефект. Постојат различни стратегии за намалување на влијанието на инхибиторите. Изборот на соодветна полимераза може да има значително влијание врз активноста на инхибиторот. Други докажани методи за намалување на PCR инхибицијата се зголемување на концентрацијата на полимеразата или примена на адитиви како што е BSA.
Инхибицијата на PCR реакциите може да се демонстрира со употреба на контрола на квалитетот на внатрешниот процес (IPC).
Мора да се внимава да се отстранат сите реагенси и други раствори во комплетот за екстракција, како што се етанол, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, изопропанол и фенол, од изолатот на нуклеинска киселина со темелно миење. Во зависност од нивната концентрација, тие можат да ја активираат или инхибираат PCR.